长期运动对老年小鼠骨骼肌线粒体复合物的影响

摘要 目的:研究长期运动训练对老年小鼠骨骼肌线粒体复合物 I 和复合物 Ⅳ活性的影响,并探讨其机制。

方法:以C57 BL/6J雄性小鼠跑转笼为运动方式,通过分光光度法和极谱氧电极法测定线粒体复合物 I和复合物 Ⅳ的活性。 结果:随着小鼠年龄的增长,

骨骼肌线粒体复合物 I (NADH脱氢酶)活性显著下降,复合物 IV (细胞色素氧化酶)活性无明显变化。经过 8个月运动训练的小鼠骨骼肌线粒体复合物 I及复合物 IV 活性明显升高,显著高于同龄对照鼠甚至高于5月龄鼠。结论:运动训练在一定程度上致骨骼肌线粒体功能产生适应性变化。

关键词:运动训练;骨骼肌线粒体;复合物I;复合物IV

线粒体DNAmt DNA 编码的复合物I和IV的活性随增龄而下降明显,但长期运动对复合物 I和 IV 的研究报道很少。本文以C57BL/6J 雄性小鼠跑转笼为运动方式, 研究了从5月龄开始进行为期8个月的长期运动训练对老年小鼠骨骼肌线粒体复合物 I和复合物 IV 活性的影响。

1 资料和方法

1. 1 实验动物运动模型的建立 本研究选择30只近交系C57BL/6J雄性小鼠为实验对象,2月龄小鼠购自第一军医大学实验动物中心。小鼠5月龄后随机取 10只处死进行相关指标的测试,此组为5月龄鼠。随机取10只开始运动训练,训练的方式为跑转笼 ( running wheel) ,将小鼠放进直径为17cm的带轴承转笼,让其主动跑笼,第1天跑10 min ,以后每天增加10 min ,直至每天1h ,自动记录跑笼圈数。每天跑笼1h ,每周5 d ,所有运动训练均在动物暗周期6pm～10 pm完成,剩余10只对照组在相同时间放进转笼,但转笼固定不动。8个月后均达13月龄。

1. 2 主要试剂和仪器NADH、细胞色素C、抗坏血酸钠。主要仪器有:731紫外分光光度计,氧电极,记录仪。

1. 3 实验方法

1. 3. 1 小鼠骨骼肌线粒体的制备 将小鼠断头处死取腓肠肌,剪碎后电动匀浆器匀浆, 差速离心分离线粒体。分离介质为0. 25 mol/L蔗糖, 1mmol / L EDTA , 5 mmol / L Tris - HCl(pH7.4) 。所有操作均在 4℃以下进行。1. 3. 2 线粒体复合物 I 活性的测定 参考 Schneider[1]的方法。反应体系中含 Tris - Hcl 缓冲液(p H7. 5) ,10 mmol / L 正铁氰化钾, 15 nmol / L NADH ,记录 410 nm 处吸光度的下降值。酶活性以每毫克蛋白计算,摩尔消光系数为 1 030。

1. 3. 3 线粒体复合物 IV 活性的测定 通过极谱氧电极法测定密闭反应体系中氧饱和度的变化, 确定氧的消耗量, 以计算样品中酶的活性。反应体积1. 6 ml , 25℃恒温, 反应介质为10mmol / L磷酸钠,pH 7. 4 ,4. 5 mmol / L抗坏血酸,2. 7 mmol / L四甲基- 对苯二胺盐酸盐( TEMPD) ,1 mmol / L 细胞色素 C。开动磁力搅拌器,待平衡后将线粒体悬液注入反应室,记录仪曲线下降,根据记录仪走纸的格数来计算酶的活力,酶活力以每秒内每分子细胞色素 C转移的电子数(e - / s. heme a)为单位。1. 3. 4 统计处理 所有实验数据由 Excel 统计软件处理 , 以x ±s表示,t 检验。

2 结果

结果表明,对照组随着小鼠年龄的增长,骨骼肌线粒体复合物 I (NADH脱氢酶) 活性显著下降, 复合物 IV (细胞色素氧化酶)活性无明显变化。经过8个月运动训练的小鼠骨骼肌线粒体复合物 I 及复合物 IV 活性明显升高, 显著高于同龄对照鼠甚至高于 5月龄鼠。

3 讨论

研究证实线粒体呼吸链上的某些酶是由线粒体DNA (mtDNA)和核DNA (nDNA)共同编码的。由于 mt DNA 特殊的结构特点及所处的位置 (线粒体内膜,自由基产生的主要来源) 所以mt DNA很容易受到自由基损伤, 又缺乏较完善的修复机制 ,从而引起损伤积累,造成呼吸链酶的缺陷,影响氧化磷酸化功能[2 ,3 ],许多研究证实,mt DNA 突变随增龄而升高,氧化磷酸化能力随增龄而下降。许多研究表明, 线粒体的老化是细胞衰老的重要原因之一, 随着年龄的增加, 线粒体结构和功能出现异常, 由线粒体功能下降引起的细胞能量缺损可能消弱细胞活性和细胞适应各种生理应激的能力。缺血性实验对线粒体呼吸链活性的影响发现,复合物 I为最脆弱部分。有实验表明,在衰老进程中,横纹肌中细胞色素氧化酶活性显著下降[ 4 ]。该酶活性下降与线粒体产生的氧化物的增加相关。进一步的研究检测发现线粒体细胞色素氧化酶进行性和随机的丧失与年龄相关的线粒体RNA 合成的下降有密切关系。NADH 脱氢酶有 7个亚单位是由线粒体 DNA (mtDNA) 编码的 , 占总的蛋白质编码区的59. 2 % , 复合物 IV 的 3个亚单位占 24. 4 %也是由 mtDNA 编码的[ 5 ]。由于 mtDNA 在胞内的位置及其结构特性,决定了它易受线粒体氧化还原反应产生的氧自由基的攻击, 引起 mtD2NA 的突变。尤其是随着年龄的增长,组织中抗氧化剂随增龄而减少时 , 体内积累的氧化损伤作用即可导致线粒体和 mtDNA的变异,从而使氧化磷酸化反应减退。氧化磷酸化缺陷时,可严重威胁各种器官和组织的能量需求和正常运转, 从而产生临床症状和老化相关性疾病。也正基于此, Wallace 等提出了 mtD2NA 突变导致衰老和老年退化病的假说[6 ]。近期有关运动与衰老的研究表明, 运动训练可提高衰老大鼠线粒体基质酶及呼吸酶活性[7 ,8 ]。Tate 等人的研究表明衰老大鼠心肌细胞色素氧化酶活性与成年大鼠相比明显下降, 8～10周跑台训练后,该酶活性显著提高[8 ]。衰老个体线粒体酶活性的提高直接反映了线粒体功能的改善。本研究通过对小鼠长达 8个月的训练 , 发现长期有氧运动对骨骼肌线粒体复合物 I活性无影响,但却使复合物 IV 活性明显升高。由此可见,运动训练在一定程度上致骨骼肌线粒体功能产生适应性变化。根据本实验室对骨骼肌线粒体抗氧化能力的研究结果 (另文发表)分析, 长期运动训练通过诱导抗氧化酶活性的升高, 及时清除氧自由基, 减少其对生物大分子如核酸、蛋白质及脂类的氧化损伤,mtDNA 结构的完整有利于其编码的酶活性的表达。有实验发现, 骨骼肌线粒体呼吸链活性随增龄而逐渐下降, mtDNA突变率却逐渐升高, 推测体细胞随增龄而出现 mtDNA 突变是呼吸链酶活性下降的可能原因之一。运动训练可提高mtDNA编码的 mRNA (细胞色素 b ,复合物IV亚单位I ,复合物I亚单